单克隆细胞株的开发在生物制药生产（如单克隆抗体的制备）中发挥着关键作用。为了确保产品的一致性，所使用的细胞株必须来源于单个细胞。常见的克隆工作流程通常包括一至两轮的单细胞克隆，随后通过成像技术确认单细胞的成功分配。然而，传统的有限稀释法或流式细胞术等方法无法有效验证是否仅分配了单个细胞，这使得单克隆性的确认过于依赖成像的准确性。成像时的固有误差，以及需要依赖离心操作以确保所有细胞位于成像焦平面，这些都降低了实现单克隆性的可能性。因此，高精度的成像技术和检测方法显得尤为重要。

UPSIGHT20（影像式单细胞打印与成像系统）通过双重验证机制有效解决了细胞分配中的挑战。该系统的第一次验证是通过一系列喷嘴图像记录单细胞的分离情况，第二次则采用3D全孔成像技术直接捕获液体体积的图像。这种3D成像技术能够完整捕捉液体体积，从而避免了克隆后必须进行的离心操作。此外，UPSIGHT20还支持菌落生长后的实时监测，兼容96、384和1536孔板，适用于高通量工作流程，其单细胞分配效率超过98%。

本研究对4000个单细胞和近1000个生长的菌落进行了分析，结果表明：结合喷嘴图像与3D全孔成像后，细胞株的单克隆性概率超过9999%，且无需依赖荧光染色或成像技术。UPSIGHT20为克隆、克隆验证和追踪提供了一个完整的工作流程。其流程的第一步是将细胞悬浮液加载到设备中的一次性墨盒内。在单细胞分配过程中，喷嘴生成微型自由飞行液滴，并持续进行成像。图像处理算法实时评估即将到来的液滴，判断其是否包含0、1或多个细胞。如发现含有0或多个细胞，或单细胞的特征（如大小、圆度或荧光强度）不符合预设标准，该液滴将被丢弃；相反，若检测到1个单细胞且其特征符合标准，则该细胞被分配至孔板中。

系统会为每个成功分配的单细胞生成五张图像，以确认其分离与排出情况。完成分配后，使用孔板下方的第二台相机进行3D全孔成像，捕获孔中的一系列图像，这一成像设备为目标孔中分配的单细胞提供了二次确认。3D全孔成像捕获的图像数量取决于板的类型和孔中介质的体积，此成像方式消除了对孔板进行离心的需求。

在克隆后的阶段，UPSIGHT20能够对具有理想生长曲线的特定克隆进行成像并追踪其群体生长。因为UPSIGHT20不仅能快速且高效地处理图像，只需约3分钟即可处理一个384孔的板，这使得后续的高通量群体追踪变得更加便利。

喷嘴图像与3D全孔成像结合进一步验证了细胞在孔板中的分布情况。与有限稀释法或流式细胞术等传统方法相比，UPSIGHT20在单细胞分配过程中提供了更可靠的验证，单细胞分配效率超过98%。然而，算法在某些情况下可能会误判为仅分配了一个细胞，实际可能是两个相互粘连的细胞。这就需要引入3D全孔成像作为单细胞分配的确认方法，以确保仅有一个细胞被分配。

通过对UPSIGHT20的评估，我们计算了相关的误差率。本研究采用红色和绿色1:1混合的CHO细胞，以评估单细胞分配和3D全孔成像的错误率。根据喷嘴图像将4000多个细胞分配到孔板中，发现41个孔实际上包含两个细胞，确认喷嘴图像的误差率为10%。对于3D全孔成像的误差率，则通过保留一部分孔板用于菌落评估进行比较。经过评估，共识别了1800多个孔中的991个菌落，其中有2个混合颜色的菌落被错误分类，得到3D全孔成像的误差率为0.7%。将这两个误差率相乘，得出UPSIGHT20提供的单克隆性概率超过9999%。

UPSIGHT20的3D全孔成像过程在图像堆叠位置之间保持一致，评估显示细胞的平均位置位于图像堆叠的中间层，标准偏差为42。由于细胞沉降速度较慢，因此在分配后不太可能立即位于孔板的下部。只需从液体体积的中心开始成像，从而有效减少处理时间，同时保持较高的单克隆性概率。

综上所述，UPSIGHT20是一种多功能设备，具备单细胞的分离、验证与菌落生长监测能力。其创新的3D全孔成像技术为每个孔提供全面的液体体积成像，完全不依赖离心孔板进行单细胞分配验证。这一创新不仅显著提升了实验的灵活性和准确性，还通过对单细胞的成像与记录，为克隆性验证提供了可靠的双重保障。以上研究表明，该工作流程实现了超过9999%的单克隆率，并且提升了成像速度，进一步增强了实验效率和可靠性。

总之，尊龙凯时人生就博不仅提升了单细胞研究的准确性与效率，更为未来的细胞生物学研究提供了强有力的工具支持。这一技术的出现，必将推动细胞研究领域的进步，为深入理解细胞行为与特性奠定基础。