## 一、细胞培养条件

尊龙凯时人生就博的人胚肺成纤维细胞MRC5具有良好的生长特性，适合在无血清条件下进行冻存。推荐的冻存液为无血清冻存液（货号：C7001）。其培养体系为MEM培养基，加入10% FBS、1% NEAA、1%丙酮酸钠、1% L-谷氨酰胺及1% P。传代方式建议首次以1:2的比例进行。

细胞培养后需在2天内更换培养基，使用无菌离心管收集培养基以进行效果对比。如果对比效果不理想，建议直接购买我们的完全培养基。

## 二、细胞处理说明

收到细胞后，应培养至稳定状态，并将细胞瓶完全灌满培养液并密封。收到细胞后，用75%酒精对细胞瓶进行消毒，然后在超净台内严格遵循无菌操作规程。将细胞瓶置于37℃、5% CO2培养箱中静置3-4小时，以确保细胞状态稳定。用显微镜观察细胞生长情况，并对不同倍数拍照保存（建议拍摄40x、100x、200x各一张），前三天的照片为售后依据，未提供照片将默认收到状态良好。

在传代后，建议使用原瓶的完全培养基和自行配置的完全培养基进行对比培养，换液后一定要将瓶盖拧松。

## 三、细胞培养步骤

### a、细胞传代

当细胞未超过80%汇合度时，需将完全培养液收集至离心管中，保留5ml培养基于37℃、5% CO2孵箱培养；若细胞密度超过80%，则需进行传代。具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，并用不含钙、镁离子的PBS对细胞进行1-2次润洗。
2. 加入0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟。在显微镜下观察细胞变化，若细胞大部分变圆并脱落，迅速将培养瓶取回，轻敲培养瓶，并加入5ml以上的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使之完全脱落后吸出，而后将悬液转移至15ml离心管中，以1000RPM离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 将细胞悬液按1:2的比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

### b、细胞冻存

细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，需进行冻存处理。步骤如下：

1. 弃去T25培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次。
2. 添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液至培养瓶中，观察细胞变化，待细胞变圆后加入5ml完全培养液终止消化，并轻轻吹打使细胞脱落。然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清液，沉淀细胞加入1ml的无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转移至冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱。如果后期要转入液氮罐，需在-80℃冰箱中存放超过24小时再转入液氮。

### c、细胞复苏

分步骤操作如下：

1. 从液氮中取出冻存管（注意佩戴防护面具），迅速置于37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶。然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管，1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，放置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养。
4. 第二天更换为新鲜的完全培养基以继续培养。

## 四、注意事项

在运输过程中，部分细胞可能因为贴壁不牢而出现脱落，属正常现象。如果脱离较多，可以将培养瓶内的培养液收集至离心管，进行1000rpm离心5分钟，以便后续做过渡培养。沉淀后可加入胰酶，轻轻吹打，消化1-2分钟后，再加入5ml完全培养基终止反应，并进行离心和重悬，按1:2比例进行分瓶传代，补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，并置于培养箱中。

## 五、售后条款

### 1. 可能重发的情况：

1. 运输过程中出现的问题，如细胞丢失、瓶身破损等，均可重发。
2. 收到产品48小时内若出现污染问题，请提供实验结果，我们将核实后决定是否重发。
3. 细胞复苏后的存活情况不良，需提供真实细胞状态照片，重发条件亦成立。
4. 如细胞在常温运输后出现问题，或在未开封情况下发生污染，可重发。
5. 细胞活性问题需在收到产品7天内反馈，用台盼蓝染色法进行细胞活力鉴定，核实后可重发。
6. 细胞收到当天及之后2、3天内请拍照记录，若3天未告知将视为产品合格。
7. 若在4-7天内出现问题，需提供前三天的照片及详细的实验步骤便于技术人员判断责任。

### 2. 不予以重发的情况：

1. 若细胞污染是由客户造成，不予重发。
2. 不正确的操作导致细胞状态不佳，亦不予重发。
3. 使用非推荐培养体系造成的细胞问题，不予重发。
4. 未能提供细胞培养前三天照片的，不予重发。
5. 其他处理导致的细胞状态问题，亦不予重发。
6. 在收到细胞2天内未告知问题，不予重发。
7. 视具体情况而定。

尊龙凯时人生就博致力于为客户提供高质量的细胞培养解决方案，并确保售后服务的有效性与便捷性。