实验准备

人多能干细胞培养基的配制

（1）在2-8℃条件下解冻hPSCMediumSupplement，待融化后轻轻摇匀，按需分装，立即使用或储存于-20~-80℃，以避免反复冻融；（2）按照1:50的比例，将hPSCMediumSupplement(10mL)添加至hPSCMediumBasalMedium(500mL)中，充分混匀，形成人多能干细胞培养基(abs9403)；注意，混合后的培养基在2-8℃下可稳定储存2-3周，不建议使用超过3周的培养基。（3）实验试剂需平衡：人多能干细胞培养基应在室温、避光条件下平衡；PBS、消化液等需加热至37℃，但需避免将培养基加热至37℃水浴，以防活性因素损失。

操作方法

hPSC细胞复苏

1、实验操作步骤：
11、基质胶包被培养板：取出6孔板/12孔板，每孔加入1mL/0.5mL即用型基质胶(abs9410)，轻轻晃动使其完全覆盖培养皿底部，置于37℃培养箱中孵育1-2小时；实验前需在超净工作台/生物安全柜中平衡20分钟。如暂时不使用，可用Parafilm封口后在2-8℃下储存，并于1周内使用。注意：①冻存的干细胞数量约为1×10⁶ cells/mL，适用于6孔板1孔；②即用型基质胶对温度敏感，使用后需立即放回4℃冰箱保存，且不得直接触碰基质胶液面，以免影响其质量。

12、先将2-3mL的干细胞培养基加入15mL离心管中备用。

13、解冻：将冻存管从液氮中取出，迅速浸入37℃温水中，快速摇动，确保在1-2分钟内完全解冻；注意：减少细胞暴露在室温中的时间。

14、离心：解冻后的冻存液逐滴加入含有干细胞培养基的15mL离心管中，将管子放入低速离心机中平衡后，以1000rpm离心3分钟；

15、重悬：离心后弃去上清液，加入1mL人多能干细胞培养基，轻柔吹吸混匀，进行3-5次吹吸。

16、接种：均匀混匀后，弃掉已平衡的即用型基质胶，将细胞悬液加入已包被好的6孔板中，使每孔最终补全至2mL表达体系。

17、培养：接种后的培养板可在倒置相差显微镜下观察接种的干细胞密度及细胞团块大小，4个细胞以上的团块为合格，轻轻晃动使细胞均匀分布；放置在37℃，5%CO₂的培养箱中培养，第二天观察细胞贴壁情况；

18、换液：自复苏起，每24小时需更换一次培养基。注意：培养基中的活性成分仅能维持一天，因此需要及时更新新鲜培养基。

hPSC细胞传代

2、实验具体操作步骤：
21、清洗：吸去原有培养基，缓慢加入1mL PBS缓冲液并轻轻晃动，然后沿培养皿边缘吸去PBS缓冲液；

22、消化：在6孔板中加入2mL/孔人多能干细胞消化液(abs9409)，使其覆盖皿底，置于37℃培养箱中2-5分钟；注意：消化时间依据干细胞生长密度和情况而异，建议为2-5分钟。消化过程中可通过显微镜观察细胞状态，当观察到大部分克隆边缘及内部细胞间隙出现，即可终止消化；

23、吹打：吸去消化液后，加入2mL人多能干细胞培养基，使用移液枪轻柔吹打培养皿底，进行3-5次，促使细胞集落脱落并转移至15mL离心管中；注意：吹吸时力度应轻柔，以避免形成单细胞；若有少量细胞无法脱落，属正常现象；如大多数未能脱落，则需延长消化时间。

24、离心：以1000rpm离心3分钟，弃去上清；

25、接种：用干细胞培养基轻柔吹打细胞5-10次，吸掉包被培养板中的基质胶，将细胞悬液加入培养板中，再补全至每孔2mL的培养体系。注意：吹打细胞时要温柔，次数不宜超过10次。

26、换液：自传代开始，每24小时需更换一次培养基，确保及时提供活性成分。

hPSC细胞冻存

3、实验具体操作步骤：
31、清洗：同21；
32、消化：同22；
33、吹打：同23；
34、离心：同24；
35、重悬：离心后弃去上清，加入2mL ES/iPS细胞冻存液(abs9412)，并轻柔吹吸混匀3-5次后，转移至冻存管中。注意，冻存液应立即使用，并及时放回4℃冰箱；

36、记录：在冻存管上标记细胞种类、冻存时间、操作人员及细胞批次信息；

37、-80℃冰箱冻存：将冻存管置于-80℃冰箱过夜，注意应直立放置，避免倾斜或横放；

38、液氮冻存：24小时后，将-80℃冰箱中的细胞移至液氮中以进行长期冻存。

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