近年来，细胞与基因治疗领域取得了显著突破。其中，多种以anti-CD19和BCMA为代表的CAR-T免疫细胞疗法在血液瘤治疗上取得了成功，而基于AAV载体的基因疗法更是为罕见疾病提供了新的治疗选择。与此同时，CRISPR基因编辑技术的迅猛发展标志着基因治疗的新时代到来。体外基因编辑疗法CTX001即将上市，体内基因编辑疗法也展示了良好的临床数据。然而，CRISPR技术的安全性问题仍引发广泛关注。由于其直接作用于基因组DNA，任何不准确的改变都有可能造成长期风险。

为应对这一挑战，FDA等监管机构提出了关于基因治疗安全性的指导原则，主要集中在两个方面：一是对基因组完整性的评估，包括可能出现的染色体重排、大块插入或缺失以及外源DNA整合带来的潜在致癌性；二是识别脱靶编辑活动，包括其类型、频率和具体位置。本文将详细介绍各类脱靶检测技术。

脱靶效应是指基因编辑过程中，CRISPR-Cas9等工具除了对靶目标序列进行编辑外，可能错误地作用于其他与目标序列相似的非目标位点，从而导致基因组发生意外改变。为了确保基因编辑的安全性和有效性，科学家们开发了多种方法来检测和评估脱靶效应。这些检测方法根据实验条件可以分为体内和体外检测两类。

体内检测方法

体内检测方法是在活细胞或生物体内进行脱靶效应评估，此类方法通常更接近真实的生物学环境。

GUIDE-seq

GUIDE-Seq（Genome-wide Unbiased Identification of DSBs Enabled by Sequencing）是一种强大的工具，用于检测CRISPR-Cas9基因编辑系统的脱靶效应。该方法通过向细胞内引入一种双链寡核苷酸标记物（dsODN），这种标记物可以插入到Cas9产生的DNA双链断裂位点。然后，利用高通量测序技术识别这些被标记的位点，从而全面发现潜在的脱靶位置。

✔ 优点：提供全基因组水平的脱靶位点信息；能够直接检测体内真实的双链断裂事件；检测低频脱靶事件的能力强。

✖ 缺点：实验操作相对复杂，要求较高技术水平；难以标记的脱靶位点可能会被遗漏。

➡ 应用场景：基因治疗的安全性评估、优化CRISPR工具、基础研究等。

DISCOVER-Seq

DISCOVER-Seq（Disruption of Cas9 binding sites followed by sequencing）是一种创新性方法，旨在监测Cas9与DNA结合位点的变化，以揭示潜在的脱靶位点。这种相对较新的技术能够在活细胞环境中进行，提供了真实的实验条件。

✔ 优点：在活细胞中实时监控Cas9-DNA相互作用，非侵入性检测减少了对细胞生理状态的影响；具有高特异性和准确性。

✖ 缺点：实验设计复杂，需要特定设备和技术支持；对于某些难以转染的细胞类型可能不适用。

➡ 应用场景：基础研究到临床前试验的广泛领域，包括评估新开发的CRISPR工具的安全性。

体外检测方法

体外检测方法是在实验室条件下进行的，通过使用从生物体提取的成分或合成材料来测试，提供对特定因素的精确控制。

Digenome-seq

Digenome-seq是一种高通量测序方法，用于全面检测CRISPR-Cas9基因编辑系统的脱靶效应。该方法的原理是模拟Cas9核酸酶的切割作用，利用纯化的基因组DNA进行消化处理，然后对消化后的DNA进行全基因组测序。

✔ 优点：能够无偏见地鉴定全基因组脱靶位点；提供比计算预测更高的准确性。

✖ 缺点：可能遗漏仅在细胞内环境中发生的脱靶事件；需要大量的起始DNA。

➡ 应用场景：验证新设计的sgRNA特异性、Comparing不同Cas9变体等。

WGS全基因组测序

全基因组测序（Whole Genome Sequencing, WGS）是一项用于确定个体基因组中全部DNA序列的技术，能够提供最全面的基因组信息，有助于深入理解基因功能及疾病的关系。

✔ 优点：识别多种遗传变异类型，适用于基础科学研究、医学诊断等领域。

✖ 缺点：数据量庞大，需强大的计算资源及专业的生物信息学分析能力。

➡ 应用场景：医学诊断、个性化医疗等。

在科学与临床实践中，CRISPR技术具备巨大的潜力与风险，脱靶现象是最值得关注的一类风险。在未来的研究中，如何评估和降低这一风险至关重要。我们期待更多高效、准确的脱靶检测技术问世，以进一步提升基因编辑技术的安全性与可靠性。

尊龙凯时人生就博致力于提供一站式基因编辑安全性评估平台，涵盖靶点设计、GUIDE-seq和AID-seq脱靶检测等多种管线。该平台可持续为客户提供高效、安全的服务。我们期待与您携手，共同推动基因治疗技术的发展。