### 培养条件

气相条件：95%空气 + 5%二氧化碳；温度：37℃。使用的培养基为DMEM，添加10% FBS和1% P/S。A-673细胞系来源于15岁女性的横纹肌肉瘤，能够在软琼脂中形成克隆并在经过免疫抑制处理的小鼠中成瘤。该细胞系具有四个以上的标志性染色体、一个额外的F染色体以及两个异常的B染色体。

### 传代方法

第一个传代建议采用1:2的比例。传代情况中，每两天更换一次培养液。建议同时采购和培养，以获取更优惠的价格。收到细胞后，处理至良好状态后灌满完全培养液并封好瓶口，这是运输细胞的最佳方式。

收到细胞后，使用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，接着放入超净台内严格进行无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态后，再进行后续处理。使用显微镜观察细胞的生长情况，并拍摄不同倍数的照片保存（建议保存40x、100x和200x的各一张）。前三天的照片是重要的售后依据，若未提供照片则默认状态良好。

### 细胞培养步骤

#### a. 细胞传代

若细胞汇合度未超过80%，则将完全培养液收集至离心管，留5ml在37℃、5% CO2的孵箱中培养；当细胞密度超80%时，可以进行传代。贴壁细胞的传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶约1-2ml至培养瓶内，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，显微镜下观察细胞状态，若细胞大部分变圆并脱落，迅速返回操作台轻敲培养瓶后加入5ml以上完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打使细胞完全脱落后吸出，将悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清，重新加入1-2ml完全培养基重悬。
4. 将细胞悬液按1:2的比例分瓶（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

#### b. 悬浮细胞的传代步骤

1. 采用半换液法处理，竖着放置培养瓶于培养箱静置约1小时，轻轻吸掉3ml左右的培养基，然后补充3ml完全培养基。如果培养基变色较慢，可以直接添加约500ul FBS，传代时可直接补充5ml培养基，分为两个新培养瓶培养。通常这种方式可以在3次传代后进行一次离心，以去除死细胞。
2. 离心换液法：若需分瓶，可将细胞悬液收集至离心管中，1000 RPM离心5分钟，弃去上清，补加1-2ml培养液重悬后，将细胞悬液按1:2的比例分到新的T25瓶中，添加6-8ml新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代视情况按1:2至1:5的比例进行。

### 细胞冻存与复苏

#### 1. 细胞冻存

1. 待细胞生长至覆盖培养瓶80%面积时，弃去培养液，并用PBS清洗细胞一次。
2. 加入0.25%胰蛋白酶约1ml，观察细胞回缩变圆后加入5ml完全培养基终止消化，轻轻吹打细胞使其脱落，转移悬液至15ml离心管，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，加入1ml的无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转移至冻存管中。
4. 直接将冻存细胞放入-80℃冰箱保存。若后期需转入液氮罐，需在-80℃保存24小时以上再进行转移。

#### 2. 细胞复苏

1. 从液氮中取出冻存管（注意佩戴防护面具），快速置入37℃水浴解冻，直至冻存管内无结晶，然后用75%酒精擦拭管外壁。
2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃上清，用5ml完全培养基重悬，然后接种至T25培养瓶，放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。
4. 第二天更换为新鲜的完全培养基继续培养。

### 注意事项

有些细胞贴壁不牢，经运输后可能出现细胞脱落的情况，这属于正常现象。如脱落较多，可收集所有培养液至离心管，1000 RPM离心5分钟，收集上清进行过渡培养；沉淀加入胰酶1-2ml，轻轻吹打重悬，消化1-2分钟后再加5ml完全培养基终止反应。再进行离心，弃去上清，加入1-2ml完全培养基重悬。最后按1:2比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

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